Historial de August 2009

Mutagénesis aleatoria

En la entrada anterior del blog estuve comentando una de las técnicas que estaba llevando a cabo en el laboratorio. Ahora voy a hablaros de otra, que si bien aun no he hecho, pronto estará dentro de los procedimientos aprendidos durante este periodo de beca.

Como ya expliqué en la entrada anterior es muy fácil hacer substituciones de unos aminoácidos por otros mediante la construcción de oligos que ya incluyen las mutaciones y por amplificación con PCR. Esto se puede realizar si se conocen muy bien los efectos que va a provocar la introducción de la mutación, aun así en muchas ocasiones el resultado que se obtiene no es el esperado porque se sustituye un aminoácido pensando en el efecto directo que va a causar esta sustitución pero se desconoce totalmente los posibles efectos que va a tener en el resto de la estructura de la proteína. Ya que la sustitución del residuo puede provocar un cambio de orientación en otro residuo situado a decenas de pares de bases y que incluso afecte a la actividad catalítica de forma negativa y produzca un efecto totalmente contrario al esperado.

Por eso en determinados casos la mutagénesis aleatoria puede ser muy útil para lo que se conoce como diseño racional. La mutagénesis aleatoria se puede conseguir de diferentes formas, mediante agentes químicos, como por ejemplo la hidroxilamina, el ácido nitroso, cambiando la concentración de Mg 2+ que actúa como cofactor en la DNA pol, mediante PCR y con diferentes oligos con mutaciones al azar, etc.. Pero estas técnicas quedan restringidas a regiones concretas del gen.

Uno de los métodos más interesantes (al menos desde mi punto de vista) y bastante utilizado para la obtención de proteínas modificadas es la evolución dirigida.

Este proceso intenta imitar el proceso de evolución darwiniana pero in vitro, combinando las mutaciones genéticas con la selección natural. La evolución dirigida consta de dos etapas diferenciadas, por un lado una etapa de mutagénesis aleatoria que se consigue mediante la técnica conocida como DNA-shuffilg que consiste en una primera etapa de PCR normal y posteriormente en una digestión con DNAsa. Del producto de la digestión se seleccionan los fragmentos de entre 50 y 150 pb y se usan como cebadores  para la siguiente PCR. Además se usa una polimerasa de baja eficiencia que introduce mutaciones con mayor frecuencia que las que se usan habitualmente en PCR.

El producto de todo este proceso es clonado en un vector para ser expresado en E.coli y posteriormente se chequean los mutantes y se seleccionan aquellos que tienen mayor interés.

Se obtendrá un mayor éxito cuanto mayor sea el número de variantes fenotípicas obtenidas puedan ser examinadas y en muchas ocasiones se llega a la conclusión de que las proteínas estudiadas son mucho más flexibles a la hora de incluir mutaciones de lo que se pensaba.

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Mutagénesis dirigida

Pensé que con el verano tendría más tiempo para escribir en el blog y que tendría más cosas que contaros…pero la verdad es que me equivocaba. Tal vez sea el calor, o la pereza que da escribir algo después de estar todo el día trabajando, pero últimamente no estoy muy inspirado.

El trabajo de investigación es muy duro, y hay que dedicarle muchas horas, y es por eso que al estar tan inmerso en el tema no tengo mucho tiempo para dedicarle al blog.

Después de estar un mes trabajando junto con otra compañera ya tengo mi propio proyecto, que más bien es la segunda parte de otro proyecto que se llevó a acabo en el laboratorio por otro compañero y con el que se obtuvieron resultados bastante interesantes. Soy consciente que tengo poco tiempo para poder hacer muchas cosas…pero estoy contento de poder trabajar de forma autónoma y de poder decidir aspectos de los experimentos que estoy llevando acabo.

El proyecto consiste básicamente en modificar una beta glucosidasa (encargada de hidrolizar celobiosa) para que tenga actividad galactosidasa. Si se compara la estructura de la beta glucosidasa con la que estoy trabajando con la de una galactosidasa se puede ver como las estructuras son muy parecidas, y el objetivo es cambiar unos aminoácidos por otros para que la glucosidasa tenga una mayor actividad galactosidasa.

La verdad es que hay muchos más detalles que contar y muy interesantes pero no sé hasta que punto puedo contar las cosas que hago en el laboratorio por ahí…así que al menos con esto os hacéis una idea del porqué escribo tan poco por aquí…